葡萄的品质受到低温胁迫的显著影响，而耐寒野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制是进行葡萄遗传改良的重要关键。这一过程与WRKY转录因子的功能密切相关，它在冷胁迫响应中作用显著，主要通过结合W-box元件来调控次生代谢、碳水化合物合成等重要过程。近年来的研究显示，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），使淀粉分解为可溶性糖，从而调节细胞渗透压及稳定细胞结构，并直接调控过氧化物酶（VaPOD36）以清除活性氧（ROS），从而增强耐寒性。然而，VaWRKYs在提高葡萄耐寒性方面的具体功能和机制仍需深入探索。

最新发表在《Horticulture Research》上的研究表明，VaWRKY65在冷胁迫条件下通过调控碳水化合物代谢及抗氧化机制来提高葡萄的耐寒性。VaWRKY65激活VaBAM3以促进可溶性糖的积累并调节渗透压，同时激活VaPOD36的转录，清除ROS，从而为葡萄提供双重的耐寒保障。

研究人员通过瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，在烟草叶片中观察到了VaBAM3启动子活性在冷处理下显著升高。通过酵母单杂交筛选法及双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制。结果显示，VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性来调节耐寒性，而启动子的突变则抑制了这一增强效果。

另外，研究还运用双荧光素酶系统探讨了VaWRKY65在冷胁迫下对ROS的调控机制。结果显示，VaWRKY65结合并激活VaPOD36的表达，上调VaPOD36能够提升POD酶活性，从而增强抗氧化能力，降低ROS的积累，从而显著提升植物的耐寒性。

实验方法的简述如下：研究团队将VaBAM3启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合后，转化至根瘤农杆菌GV3101，再将该菌株或空载体转入本氏烟草叶片。经过2天的共培养（25℃）后，进行低温处理72小时（4℃）。观测LUC荧光时，喷洒1mM D-荧光素溶液，于黑暗中放置5分钟后，利用勤翔IVScope7000植物活体成像系统进行发光检测和数据分析。

尊龙凯时，作为生物医疗领域的重要参与者，将持续关注植物耐寒性研究的最新进展，为未来的葡萄遗传改良应用提供科学依据。